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琼脂糖电泳法测定多糖的操作步骤
来源于:开云体官网入口·(中国),浙江联硕生物科技有限公司 | 发布时间:2023/2/23 15:48:00

琼脂糖电泳法测定多糖的操作步骤:
1. 在25mL 巴比/妥缓冲液中加入0.150g琼脂糖,在 80℃下水浴加热或用密封式恒温可调电加热器加热琼脂糖溶液,使其溶化。
2. 将制胶槽(又称胶床)用胶布封闭两端,缓慢灌注溶化的琼脂糖溶液(胶厚约3.5mm),防止胶面有气泡产生,静置,冷却至少 30min;然后插上梳子,并检查梳孔附近是否有气泡。
3. 倒入少量电泳缓冲液,润湿胶面,然后倾倒掉缓冲液,将梳子缓缓拔出,轻轻拆去制胶槽上的胶布,将制胶槽放置于电泳槽内。
4. 在电泳槽内注入电泳缓冲液约200mL,使液面高于胶面约1~2mm;(液面太高不利于加样。)
5. 用微量加样器注入样品5μL,溴酚蓝(1~2μg/μL)或甲/酚红作为示踪剂(dyeindicator);使用甘油(样品:甘油=5:1~1:1)作为沉样剂。
6. 检查电源极性,使得阴极靠近加样端。电泳仪电压固定设置为80V(或 2~10V/cm)(注意电过程中电压可能变化,注意调整电压,使其始终不变),电泳约 40min~60min,停止通电;要准确记录电泳时间的起始时间。
7. 电泳结束后,小心取出琼脂糖胶,放置到直径为18cm的培养皿中。
8. 将凝胶板放置于一六烷基三甲基/溴化铵溶液(0.1%)中约 4h(>4Hr)。
9. 取出后,以干燥滤纸铺盖于凝胶上,小心轻压脱水数次;(在 80℃烤箱中干燥,然后测定标淮样品和待测样品的斑点位置:本实验室未采用)
10. 倾注约20mL的甲/苯胺蓝染色液于托盘中(使染色液充分浸过胶面),并放置于STS-2型脱色摇床上(速度指示为30)。将冷却后的凝胶放于该托盘内,打开脱色摇床、轻轻振摇,染色10~30min(通常为15min~20min)。
11. 倾倒去(或用洁净针管吸去)染色液,缓缓加入约30mL脱色液在STS-2型脱色摇床上,缓缓脱色约 30min至背景无色为止。
12. 重复10和11步进行复染(约 30min)和(采用配方G)脱色(脱色约40-50min),可见多糖的电泳斑点清晰,向阳极移动。
13. 根据指示剂(或称示踪剂)与多糖的电泳斑点位置,记下各组分电泳迁移率。
14. 洗涤及整理使用过的物品。

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