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红细胞裂解液操作步骤
来源于:开云体官网入口·(中国),浙江联硕生物科技有限公司 | 发布时间:2023/1/31 15:04:00

操作步骤:
(一)贴壁培养细胞
1、取NP-40裂解液置于室温融解混匀,加入 PMSF,使 PMSF 终浓度为1mM。
2、去除贴壁细胞的培养液,用PBS、生理盐水或无血清培养液清洗1次,低速离心,弃上清,留取沉淀。
3、按照6孔板每孔加入150~250μl含有PMSF的NP-40裂解液,移液器轻轻吹打,使裂解液和细胞充分接触。置于冰上或4℃裂解,通常裂解液作用于细胞1~3s内,细胞就会被裂解。
4、10000~12000g,4℃离心5~10min(如无低温离心机,室温下离心亦可),取上清。
5、后续的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
(二)悬浮培养细胞
1、取NP-40裂解液置于室温融解混匀,加入PMSF,使PMSF终浓度为1mM。
2、低速离心悬浮细胞,弃上清,收集沉淀。
3、用手指轻弹细胞,使其松散。按照6孔板每孔细胞加入150~250μl含PMSF的NP-40 裂解液。如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到200~250μl。再用手指轻弹以充分裂解细胞,充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。
4、10000~12000g,4℃离心5~10min(如无低温离心机,室温下离心亦可),取上清。
5、进行后续的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
(三)组织样本
1、把组织剪切成细小的碎片,越小越好。
2、取NP-40裂解液置于室温融解混匀,加入PMSF,使PMSF终浓度为1mM。
3、取在液氮或超低温冰箱中冷冻 30min 以上的组织,迅速研磨,研磨过程尽量控制在1~2min之内,以减少蛋白的降解。
4、按照每20mg组织加入150~250μl裂解液的比例加入含有PMSF的裂解液,冰上或4℃裂解30~60min。

 

5、步骤3、4亦可以采用如下过程:按照每20mg组织加入150~250μl裂解液的比例加入含有PMSF的NP-40裂解液。用玻璃匀浆器或组织研磨器匀浆,直至充分裂解,该过程尽量控制在1~2min之内,以减少蛋白的降解。

6、10000~12000g,4℃离心5~10min(如无低温离心机,室温下离心亦可),取上清。

7、进行后续的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

注意事项:
1. 为取得最佳的使用效果,尽量避免过多的反复冻融。建议将其适当分装成合适的量,然后置于-20℃保存。

2. 细胞裂解蛋白提取的所有操作步骤都需在冰上或4℃进行。

3. 建议在临用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1mM。PMSF可以向我公司订购。

4. 在贴壁培养细胞的操作步骤中,去除贴壁细胞的培养液后,如果血清中的蛋白没有干扰,可以不用清洗。

5. 如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液,如果需要高浓度的蛋白样品,可以适当减少裂解液的用量。

6. 在培养细胞的裂解中,如果细胞量较多,必需分装成50~100万细胞/离心管,然后再裂解。大团的细胞较难裂解充分,而少量的细胞由于裂解液容易和细胞充分接触,相对比较容易裂解充分。

7. 如果组织样品本身非常细小,可以适当剪切后直接加入裂解液裂解,通过强烈vortex使样品裂解充分。然后同样离心取上清,用于后续实验。直接裂解的优点是比较方便,不必使用匀浆器或研磨设备,缺点是不如使用匀浆器或研磨那样裂解得比较充分。

8. 如果希望获得更好的裂解效果,细菌和酵母可以分别使用溶菌酶和破壁酶消化,然后再使用本裂解液进行裂解。

9. 复融后的试剂请及时使用,避免裂解液中有效成分失效。

10. 本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

11.为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

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