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雌二醇的制备方法
来源于:开云体官网入口·(中国),浙江联硕生物科技有限公司 | 发布时间:2022/11/17 9:15:00

制备方法:

采用人骨髓来源细胞使用化合物三甲基胆蒽(MCA)诱导产生并筛选出细胞,并使用该细胞在体外合成性雌二醇;所述细胞已由中国典型培养物保藏中心保藏,保藏号CCTCC C2012173;

制备步骤为:

1)人骨髓来源细胞(HMBDCs,主要成分为人骨髓间充质干细胞)采用现有技术(本实施例采用骨髓冲洗、贴壁法)进行原代培养制备,制备的细胞培养于含15%胎牛血清的DMEM培养基,培养条件为37℃,5%CO2,直至105个细胞/培养瓶;

2)培养基中加入MCA,使其终浓度为1ug/ml,并每星期更换含MCA的培养基2次;MCA处理1周后结束;细胞在37℃,5%CO2环境中,持续常规培养;

3)培养至3个月,培养物中可见细胞中出现生殖细胞样细胞;上述生殖细胞样细胞表达生殖细胞的标志物:Oct4、Nanos3、c-Kit、DAZL、Vasa;

4)培养液中检测到雌二醇的持续表达,与未经诱导处理hBMDCs(E2=65±14.8pmol/L, n=6)相比,MCA诱导后hBMDCs中(E2=3243±947 pmol/L, n=6)雌二醇的浓度高达50倍(p<0.01)差异有显著性;重新传代后,观察到随着培养时间的延长,雌二醇浓度进行性增加,传代培养至10天左右达到高峰,高达4500pmol/L,随后逐步下降,最终维持到较高水平;

5)体内雌二醇是由卵巢中卵泡合成,在体外培养的诱导后hBMDCs中,观察到卵泡样结构的形成(为诱导后hBMDCs中产生雌激素提供细胞支持);卵母细胞的发育需雌二醇的促进,若缺乏雌二醇,卵母细胞的最大只能长到25微米;而诱导后hBMDCs中的卵母细胞样细胞体积达到40-50微米;免疫荧光证实上述大细胞为卵母细胞;

6)卵泡相关基因,包括雌二醇合成的关键性基因:STAR、p450arom、p450c17,以及卵泡发育相关基因GDF9在培养物中表达(进一步支持诱导后hBMDCs具有合成雌二醇的能力);

7)优化培养条件,增加雌二醇产生的能力,并降低培养液中血清的浓度(有利于雌二醇的进一步分离纯化);上述生殖细胞样细胞可进一步增大产生早期卵泡样结构和卵母细胞样细胞;

8)按现有方法分离、纯化,制得雌二醇。

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