001.问：要怎么样复苏细胞？

答：细胞复苏需要准备一个37℃水浴锅、手套、镊子，以及防护眼镜。戴上手套，用镊子夹住液氮罐中拿出的冻存管，然后快速在37℃水浴锅里融解细胞。防护眼镜可以防止液氮罐里刚刚拿出来的管子液氮爆炸……

002.问：培养基不够用，我能不能换一下细胞培养基啊？

答：千万别这么做，细胞都有各自适应的培养基，万一更换培养条件，细胞可能无法快速适应，导致细胞死亡。

003.问：那能不能换血清呢？

答：换的话，尽量换同一批次的血清，毕竟不同批次的血清，质量不一样，所以可能会有潜在的影响，特别是更换血清品牌，需要用一批细胞进行预实验，才行。

004.问：复苏后应不应该立马去除掉DMSO？

答：有一些细胞会对DMSO敏感，一般的培养条件来说，复苏后的细胞（含有DMSO）加入完全培养基后培养，一天后再换液，可以避免复苏后细胞的生长和粘附的问题。

005.问：什么时候需要换液？

答：这个要根据细胞的生长状态来定，当细胞代谢加快后，应该换液。细胞密度增大后，需要考虑传代。

006.问：培养基到底要不要加抗生素？

答：其实是不推荐加抗生素的，但是很多时候，都会为了保险，加上双抗。但双抗只能抗细菌，不能抗真菌哦！

007.问：啥时候用5%的CO2，啥时候用10%的CO2呢？有差别么？

答：当然有差别啦，主要看的是培养体系，培养基的缓冲体系基本上都是用碳酸氢钠缓冲体系的，培养基里的碳酸氢钠的浓度决定了CO2的量，当碳酸氢钠达到3.7g/L的时候，需要采用10%的

CO2，当碳酸氢钠达到1.5g/L的时候，需要用5%的CO2。如果你用的培养基用的是Hank's balanced salt solution (HBS，Hank缓冲液)的话，就不能用CO2培养箱了哦，因为这个体系里碳酸氢

钠浓度只有0.35g/L。

008.问：培养基在冰箱里的时候，紫红色的培养基为啥会变暗？

答：因为冰箱里没有5%的CO2啊，培养基变成碱性，当然颜色就越来越暗了……

009.问：支原体污染是否能肉眼识别？

答：能，前提是你的眼睛有2000万像素，以及4000倍放大变焦功能。一般来说，污染了支原体的细胞，生长状态会变差，用肉眼基本很难判别到底是支原体污染还是你自己培养的时候在培养

基里多加了一把盐……主要还是通过PCR检测或者是染色检测来区分支原体污染与否的。不过一旦污染，尽量丢弃，然后查看你的血清是否安全。

010.问：细胞离心的话要怎么离心？

答：有很多地方是国产离心机3000rpm离心3分钟，当然，更推荐1000rpm离心5-10分钟，这样比较不容易伤害细胞。偷摸说一句，国产离心机的3000rpm未必能达到3000，所以问题并不大。

011.问：我细胞铺板的时候量少点行不行？

答：可以，就是会长很慢……很慢……很慢……不知道有多慢的话，可以参考“克隆形成实验”。细胞数量少或稀释过多也是细胞生长的重要负面原因之一。

012.问：如何避免细胞培养过程中的污染？

答：主要还是考虑无菌环境，尽量做好操作台的灭菌，别把培养基滴落在生物安全柜的入风口，别在培养箱里把培养基打翻。这两个地方霉菌一旦滋生，那你就只能等着用甲醛熏蒸了。紫外无法杀灭霉菌，酒精也不行，只能用火，但是一定要注意安全。复苏的时候，水浴锅也需要进行灭菌处理。一旦出现污染，不要急，能救的就用抗生素救一下，但是一般情况下，选择原谅……不是……是选择扔掉……

013.问：我复苏后的细胞死亡率高是啥原因？

答：有这样几个原因哈：1）培养基质量差，2）血清质量差，3）复苏后立马离心，导致大量细胞原地爆炸，3）细胞长时间放置在-80℃，4）误把悬浮细胞当做是死细胞。

014.问：冻存管盖子裂开是咋回事？

答：冻存管刚从液氮里拿出来的时候，手用力不均一很容易导致管子变形，导致管盖受力冻裂，这个时候最好用镊子夹住（有的地方推荐用止血钳来夹）。冻存管取出后管盖一定要拧紧，从液氮中取出后由于热胀冷缩，管盖很容易松动。这样复苏的时候，万一有漏液，在水浴锅里就会直接导致污染。

015.问：培养基里L-谷氨酰胺是干嘛用的？

答：L-谷氨酰胺的主要作用是在培养细胞的能量来源，参与蛋白质合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在一段时间内会在溶液中降解，但确切的降解率确实不清楚。 L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，氨对一些细胞有毒性。

016.问：培养基里的粉红是干嘛用的？

答：主要为了颜色好看，引起食欲……个鬼……酚红一般作为培养基中pH值的指标：当培养基呈中性时为红色，呈酸性时为黄色，碱性时为紫色。另外，酚红可以模拟类固醇激素（特别是雌激素）的作用。如果要避免类固醇反应，可以在无酚红的培养基里进行培养。

017.问：胰酶里为啥要加EDTA？

答：二价的离子会抑制胰酶活性，所以加入EDTA可以螯合掉Ca、Mg这样的二价离子。胰酶也要注意不要反复冻融哦！