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细胞实验注意事项
来源于:开云体官网入口·(中国),浙江联硕生物科技有限公司 | 发布时间:2023/7/5 16:45:00

1、细胞复苏

  1. 将细胞冻存管从干冰中取出,立即放置37°水浴速融1min,见无冰晶即可不再水浴(用镊子拿取)
  2. 将细胞冻存液加入10~15ml完培中,吹打混匀,减少DMSO对细胞毒性,800rpm离心5min
  3. 弃上清,细胞沉淀进行下一步传代。

2、细胞传代

试剂与材料(贴壁细胞):

细胞:4T1乳腺癌细胞;基础培养基:1640培养基(含有生物素、 维生素 B12、对氨基苯甲酸PABA、高浓度的维生素肌醇和胆碱;不含有蛋白质、脂质或生长因子);血清:胎牛血清FBS(细胞营养液:提供基本营养物质、提供激素和各种生长因子、提供结合蛋白、提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤、对培养中的细胞起到某些保护作用);胰酶(消化贴壁细胞促附着蛋白如层黏连蛋白、纤维连接蛋白等)

实验方法:

1)试剂解冻:胰酶,培养基在37°水浴加热解冻

2)制备完全培养基:1640培养基中加入10%的血清,水平摇匀,避免震摇引起泡沫

3)细胞消化:将原来培养基倒除,用500μl首选pbs/胰酶先润洗(消化培养基里的蛋白,避免对细胞生长产生影响),去除胰酶,再沿壁(不直接加到细胞表面)加入1ml胰酶,在37°中消化3~5min(可1min左右观察消化情况)。

4)细胞传代:加入3ml完培,轻柔吹打,取1/4的消化后的细胞(其余的倒掉)加至EP管,在细胞离心机上离心1000rpm 5min,离心后的细胞,轻柔放置,防止细胞混散,可倾倒除去胰酶液(留一点点液体保持细胞活性)快速加入培养基。以10CM培养皿为例:先在皿中加入7ml的培养基。在EP管中悬空加入1~2ml左右培养基(60MM皿3ml培养基;10CM皿10ml培养基),轻柔的吹打,可以沿壁混合,使黏附细胞变成单细胞;将细胞液加入至皿中,划10次8字使皿充分被浸润,放置37°孵育。

5)注意事项:

  1. 在进行细胞实验前,需紫外照射生物柜30min,穿戴整齐后方可进入细胞房。
  2. 胰酶和培养基需37°水浴加热,至适合细胞生存温度。
  3. 开始实验前,关闭紫外照射,打开风橱和灯光。
  4. 开始实验时,需要手消且所需物品需要消毒,才可放入生物柜中,台面用酒精棉球消毒
  5. 物品摆放整齐,留出空间实验,右手用的在右手,左手用的在左手,切勿交叉。瓶盖用前可拧松,开口朝上或立放。每用完枪头盒,需盖盖,且切勿双手经过枪头盒。实验室,枪杆不要伸入瓶中或管中。
  6. 实验结束,所用试剂需标签;清理垃圾和废液;带走自己的东西;关闭灯光和通风橱。
  7. 下一次传代前,显微镜中观察细胞生长情况,密度70%~80%左右,即可传代。

 

试剂与材料(悬浮细胞)

thp-1(人急性白血病单核细胞)——显微镜观察时,晃动皿,细胞游动;1640培养基,25培养瓶,10CM培养皿,45mlEP管

实验方法

  1. 转移培养皿中的细胞至45mlEP管,移液枪吹打(沿壁吹打,使之变成单个细胞)
  2. 1000rpm,离心5min ,得到细胞沉淀
  3. 快速倾倒上清液(沿细胞堆积的另一边),保留500μl左右的液体
  4. 细胞沉淀加入4ml培养基(反复吹打),培养皿中加入7ml培养基(共10ml),25培养瓶中加入4ml培养基(共5ml)
  5. 重悬后细胞液分别移至培养皿和培养瓶中,轻微摇晃,放置37°恒温箱
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