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细胞免疫荧光实验
来源于:开云体官网入口·(中国),浙江联硕生物科技有限公司 | 发布时间:2023/7/3 17:13:00

一: 细胞培养

荧光显微镜对于直接用培养皿拍摄都没有什么压力,不过依然更建议做爬片,不仅效果更好而且更适合拍共聚焦,不想拍了也可以冷冻保存。爬片的预处理需要用多聚赖氨酸增加细胞粘附性

1,用多聚赖氨酸涂在爬片上放置30-120分钟。

2,然后用灭菌的超纯水清洗和浸泡,。

3,自然干燥了之后放在紫外下照射至少1个小时以上。爬片之前经过高温灭菌的可以不需要这么久。

4,如果用普通盖玻片而不是专用细胞爬片的话,一般还需要用0.1% Tween-20的PBS洗一下,因为根据我的经验,几个牌子的普通盖玻片都比较脏,不能直接用。

5,在培养皿内滴100uL左右的培养基,然后把爬片贴上去,这样可以贴的很牢固也没有气泡。

6,常规细胞培养,如果你的细胞贴壁能力很强,比如用胰酶都要消化3min以上的,可以不需要第一步。

二:细胞固定,通透和染色

这几个也是免疫组化的步骤,就不用解释了。直接说流程

1,4%多聚甲醛孵育细胞10min。或者用放在-20℃预冷的甲醇孵育5min。这两个都是常规固定液,非常规的也有甲醛,乙醇和丙酮等。

2,用提前在4℃或者冰上预冷的PBS洗三次,不要太用力。

3,抗原修复。不要惊讶,就是抗原修复。基本上很少有人会这么做,但是细胞免疫荧光里增加了抗原修复的步骤会让抗体更容易染上,很多做不出来的抗体都可以做出来。过程就是碱性尿素缓冲液在95℃水浴10min,自然冷却即可。

4,透化。这个步骤取决于你的抗体针对的是不是胞内蛋白,膜蛋白不需要这个步骤。常规透化剂是0.1% Triton X-100的PBS。透化10分钟然后用PBS洗干净。

5,封闭。封闭液可以用溶于PBS的BSA或者二抗物种的血清。BSA的浓度只要1%就可以,血清只要10%即可。如果你是用甲醛类做固定液,那么还需要22mg/ml的甘氨酸添加到封闭液里。如果你的一抗结合力很强或者二抗有非特异性结合,那么添加0.1%吐温20。

6,用封闭液稀释一抗,4℃过夜孵育。第二天用PBST清洗三遍后避光。孵育二抗,二抗浓度大约1抗的十倍。最后染DAPI(1ug/ml)1分钟。

7,PBS洗三遍,用抗淬灭封片剂封片。边缘处滴两滴指甲油。就可以拍照了。

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