Step 1. 制备琼脂糖微球

按照一定的琼脂糖浓度通过加热进行溶解（一般为4%或6%，相对较小的浓度制备的微球孔径较大），搅拌后得到均匀的水相溶液。温度越高，琼脂糖的粘度就越低。

不同浓度的琼脂糖黏度不一样，一般来说浓度越大粘度越高，需要溶解的时间越长；在相同的加热时间上，一般来说浓度越大所形成的微粒粒径也越大。

加热时间的长短也会对后续成球造成一定影响，如果时间过短，那么琼脂糖并未完全溶解或者是黏度较大，则会形成较大颗粒，且分散系数也不理想；

如果时间过长，则因在高温下琼脂糖可能会发生一定程度的水解，分子量下降，黏度降低，此时有利于在分散相中形成较为均匀的微球。但是如果时间过长，琼脂糖链变得过短，则会对球形度产生影响，同时也会影响机械强度。

Step 2. 制备分散相

将Span 80溶解在有机溶剂（可选种类很多，推荐用液体石蜡等）中，加热到80℃。

Step 3. 乳化

将Step 1中的琼脂糖溶液导入Step 2中的分散相，不断搅拌，乳化20min左右。

如果乳化剂用量不足，则会造成威力，球形度不够，球与球之间发生粘连；而过多的乳化剂则会造成一定程度的气泡，影响微球的均匀性。

此外搅拌速度和成球之后的半径成反比，这是因为在更大转速下，更高的剪切力的作用下乳滴会形成更小的颗粒。

Step 4. 固化成球

逐渐降低温度（建议1-2℃/min），降低到室温后琼脂糖微球基本就成型了。加入去离子水并静置2小时以上，对微球进行洗涤去除有机相，得到未交联的琼脂糖微球。

如果固化时间过短，则会导致微粒粒径分布过大，也会有较多的颗粒聚集在一起，形成较大颗粒，是平均粒径偏大。

Step 5. 进行交联

微球可以在碱性条件下与交联剂反应，常用的交联剂有环氧氯丙烷等短链交联剂、丙二醇缩水甘油醚等长链交联剂，也可以分别用短链、长链交联剂进行交联，一般先采用长链交联剂，再用短链交联剂，这样得到的琼脂糖微球机械性能会更好。

一般交联步骤如下：例如每100g琼脂糖脱水微球，加入到100 ml 1M氢氧化钠，再加入2ml环氧氯丙烷，2g硼氢化钠室温下搅拌一小时，再加热到60度搅拌一小时，后用冷水清洗备用。

在一定范围内的增加交联时间，琼脂糖微球的孔隙率得到一定程度的提升；当然不同分子量的琼脂糖形成的微球孔径也会有所不同，一般来说，大分子量的形成的孔会更小。

琼脂糖微表面带有负电荷，可能会对后续的层析分离，造成一定程度的影响，在表面修饰进行改善。