影响PCR实验结果得原因有很多:通常有以下7种。
1、引物:引物是PCR 特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA 互补的程度;
2、 酶及其浓度 ;
3、dNTP的质量与浓度;
4、模板(靶基因)核酸;
5、Mg2+浓度;
6、温度与时间的设置;
7、循环次数;
8、设备、耗材等。
常见问题及解决办法
一、PCR耗材为什么一般都是PP材质的呢?
PCR/qPCR耗材一般都是聚丙烯(PP)材质,因其为生物学惰性材料,表面不易于粘附生物分子,且有着良好的化学耐性,及温度耐受性(可121度高压灭菌,也可以承受热循环过程中的温度变化)。这些材料通常会与试剂或者样品直接接触,因而在生产制备过程中需要选用高质量的材料和良好的加工工艺。
二、不同体积的PCR 管/板,该如何选择?
PCR管的体积大多数都可以满足PCR反应要求。但是在满足实验要求的基础上,优先推荐选用低容管哦。因为低容反应管/板有着较小的上方空间,可提高热传导率并降低蒸发。而且在加样时,需要避免加样过量或过少。过量会导致热传导率下降,溢出及交叉污染,而加样过少可能会造成样品蒸发损失。大家可依据具体的实验要求选用更合适的产品。
三、为何有的PCR管是平盖,有的是凸盖呢?
当样品量较少时,都会优先选用单管或者连管。但是当反应体积需求较大时,单管可达到0.5mL。
四、不同颜色的PCR 管/板,该如何选择?
对于普通的PCR反应选用透明或者彩色的PCR管都是可以的,而彩色透明的PCR管更有助于进行样品分类管理。
五、PCR板/管材质厚度不一,是不是厚点的稳定性更好呢?
无裙边板:可适用于大多数的PCR仪或qPCR仪,但不适用于自动化、应用。移液过程中稳定性不高,需要配合板托使用。
半裙边板: 可适配标签或应用条码,及自动化应用,且有着较好的移液稳定性。
全裙边板: 非常适用于自动化实验应用,也可适配标签及应用条码。机械强度较好,可适用于凸出模块的PCR仪,且移液过程中稳定性高。
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