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什么是DNA琼脂糖凝胶电泳?
来源于:开云体官网入口·(中国),浙江联硕生物科技有限公司 | 发布时间:2023/5/25 16:39:00

1、什么是电泳?

电泳是一种利用电流根据DNA、RNA或蛋白质的物理特性(如大小和电荷)来分离它们的技术。

2、什么是琼脂糖凝胶电泳?

琼脂糖凝胶电泳是一种电泳形式,用于根据核酸(DNA或RNA)片段的大小进行分离。当施加电流时,带负电的DNA/RNA通过琼脂糖凝胶的孔隙向凝胶带正电的一端迁移,较小的片段迁移较快。由此产生的条带可以用紫外线(UV)光来观察。

然而,RNA往往会形成二级结构,而且有时同一个片段会有多个不同的种类,这会影响其迁移的方式。因此,观察到的条带并不总是代表它们的真实尺寸,图像也很模糊。

在这种情况下,琼脂糖天然凝胶(条件不会破坏分析物的自然结构)往往不用于分析RNA的大小,尽管它们可以提供数量和完整性的估计。替代方法包括RNA印迹法和变性琼脂糖凝胶电泳,它们使用的条件能够破坏二级结构。

琼脂糖凝胶也可用于根据蛋白质的大小和电荷来分离蛋白质(与DNA/RNA不同,蛋白质电荷根据所含氨基酸的不同而不同)。然而,由于琼脂糖凝胶的孔径较大,蛋白质通常在聚丙烯酰胺凝胶上分离,而聚丙烯酰胺凝胶的孔径较小,为小的蛋白质分子提供更大的分辨率。

因此,在本文的剩余部分,我们将重点讨论DNA琼脂糖凝胶电泳。

3、凝胶电泳是如何工作的?

琼脂糖是琼脂的一种成分,它形成了一个由螺旋状的琼脂糖分子组成的三维凝胶基质,这些螺旋状的琼脂糖分子在超线圈束中被氢键固定,有通道和孔隙,分子能够通过。当加热时,这些氢键断裂,使琼脂糖变成液体,并允许它在复位前被倒入模具。

 

琼脂糖在凝胶中的百分比影响了孔的大小,从而影响了可能通过的分子的大小以及通过的速度。琼脂糖的百分比越高,孔径越小,因此能够通过的分子越小,迁移速度越慢。

在分子生物学实验室中,0.7~1%的琼脂糖凝胶通常用于日常的DNA分离,对0.2~10kb范围内的片段提供良好、清晰的区分。较大的片段可以用较低百分比的凝胶来解决,但它们会变得非常脆弱且难以处理,而较高百分比的凝胶会对小片段提供更好的分辨率,但很脆且可能凝固不均匀。

由于DNA在肉眼中是不可见的,在凝固过程中,一种夹层染料如溴化乙锭(EtBr)被纳入凝胶中。这与DNA结合,并在紫外线下发出荧光,从而使DNA片段可以被观察到。存在的DNA越多,条带就越亮。

与加载染料混合的样本被放置在凝胶的一端,凝胶被浸泡在运行缓冲液中。然后电流通过凝胶槽两端的电极穿过凝胶。

当样品运行得足够远以获得足够的分离时,将凝胶从槽中取出并放在一个紫外光箱上。然后,夹层染料可以使样品条带可视化,并通过与已知条带大小的DNA marker进行比较来确定其大小。迁移距离和片段大小之间的关系是非线性的,增加了包括尺寸标记作为指导的重要性。

 

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