1.制备溶于0.1 M碳酸钠缓冲液（pH 9）的待交联蛋白样品，浓度≥2 mg/mL。

【注】：a）勿将碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液存放于0-5℃超过1周，其pH值会发生变化，建议现配现用。b）待标记的蛋白必须是未被污染蛋白，且溶解蛋白的缓冲液里不能含有叠氮钠或胺类试剂，如Tris、甘氨酸，因为这些试剂会抑制标记反应。如果缓冲液里含有上述试剂，则需将该蛋白溶液在4℃下于PBS，pH 7.4 透析过夜；透析过程中如果pH值过高（＞8.0-8.5）会损害某些蛋白。
2. 溶解FITC于无水DMSO配制成浓度为1 mg/mL的溶液。
【注】：于标记实验前新鲜配置FITC溶液，避光。
3. 对于1 mL 蛋白溶液加入50 µLFITC溶液，可按照每次5 µL的量边加边轻轻搅拌蛋白溶液；
4. 待所需FITC加入完毕，将反应液于4℃避光孵育8 h；
5. 加入NH4Cl使其终浓度至50 mM，4℃终止反应2 h；
6. 加入二甲苯青至浓度0.1%，甘油至浓度5%；
7. 通过大小孔径合适的凝胶过滤层析分离排除未被结合的FITC，分离范围在20，000至50，000（球蛋白例如抗体）。待凝胶柱平衡后，将以上反应混合液从柱顶注入，打开凝胶柱，待其全部流入柱床后，加入PBS缓冲液。
此时，可以形成两条带：a，快速移动带，也就是FITC-蛋白偶联物，先被洗脱，通常于室内光下可看到；b，慢速移动带，也就是未结合蛋白的FITC和二甲苯青。仅仅在PBS缓冲液清洗后被洗脱出来。
8. 于4℃避光储存上述偶联物，加入0.1%（w/v）叠氮化钠作为一种防腐剂。若蛋白浓度较低（＜1 mg/mL），可加入1%BSA作为一种蛋白稳定剂。
9. 偶联物中荧光素和蛋白的比值（F/P）可通过测定495 nm和280 nm处的吸光值来鉴定，F/P应位于0.3-1.0。小于该比例则信号太低，高于该比例则背景太高。