欢迎访问联硕生物官网!
购物车内有 0 件物品
异硫氰酸荧光素 (FITC)标记蛋白
来源于:开云体官网入口·(中国),浙江联硕生物科技有限公司 | 发布时间:2023/5/11 16:53:00

1.制备溶于0.1 M碳酸钠缓冲液(pH 9)的待交联蛋白样品,浓度≥2 mg/mL。

【注】:a)勿将碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液存放于0-5℃超过1周,其pH值会发生变化,建议现配现用。b)待标记的蛋白必须是未被污染蛋白,且溶解蛋白的缓冲液里不能含有叠氮钠或胺类试剂,如Tris、甘氨酸,因为这些试剂会抑制标记反应。如果缓冲液里含有上述试剂,则需将该蛋白溶液在4℃下于PBS,pH 7.4 透析过夜;透析过程中如果pH值过高(>8.0-8.5)会损害某些蛋白。
2. 溶解FITC于无水DMSO配制成浓度为1 mg/mL的溶液。
【注】:于标记实验前新鲜配置FITC溶液,避光。
3. 对于1 mL 蛋白溶液加入50 µLFITC溶液,可按照每次5 µL的量边加边轻轻搅拌蛋白溶液;
4. 待所需FITC加入完毕,将反应液于4℃避光孵育8 h;
5. 加入NH4Cl使其终浓度至50 mM,4℃终止反应2 h;
6. 加入二甲苯青至浓度0.1%,甘油至浓度5%;
7. 通过大小孔径合适的凝胶过滤层析分离排除未被结合的FITC,分离范围在20,000至50,000(球蛋白例如抗体)。待凝胶柱平衡后,将以上反应混合液从柱顶注入,打开凝胶柱,待其全部流入柱床后,加入PBS缓冲液。
此时,可以形成两条带:a,快速移动带,也就是FITC-蛋白偶联物,先被洗脱,通常于室内光下可看到;b,慢速移动带,也就是未结合蛋白的FITC和二甲苯青。仅仅在PBS缓冲液清洗后被洗脱出来。
8. 于4℃避光储存上述偶联物,加入0.1%(w/v)叠氮化钠作为一种防腐剂。若蛋白浓度较低(<1 mg/mL),可加入1%BSA作为一种蛋白稳定剂。
9. 偶联物中荧光素和蛋白的比值(F/P)可通过测定495 nm和280 nm处的吸光值来鉴定,F/P应位于0.3-1.0。小于该比例则信号太低,高于该比例则背景太高。

相关科研教学