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siRNA转染操作及要点
来源于:开云体官网入口·(中国),浙江联硕生物科技有限公司 | 发布时间:2023/4/23 17:21:00

siRNA(小干扰RNA)是一种新型的基因治疗工具,是由21-25个核苷酸组成的双链短RNA分子,能够特异性地诱导靶基因的沉默,进而抑制蛋白的表达。siRNA最初由Andrew Fire和Craig Melo在1998年提出,之后在2001年被证明可以特异性地抑制哺乳动物细胞中的靶基因表达。这一发现由David Baulcombe团队在《科学》杂志上发表,成为当年全球十大科学进展之首,他的团队并于2006年荣膺了诺贝尔生理学或医学奖。

 

siRNA的抑制作用是通过其与AGO蛋白组装成的RNA诱导沉默复合体(RISC)发挥的。一条链被降解,另一条链则与靶基因的mRNA互补配对,使其被切割降解,从而达到治疗相关疾病的目的。与传统的基因治疗相比,siRNA具有高度特异性、快速、可逆性等优点,可以应用于各种真核生物的基因功能研究,药靶发现及药物筛选中广泛应用。例如siRNA靶向恶性肿瘤的基因可以通过局部或系统性给药来治疗肿瘤,病毒感染和遗传疾病也都有涉及。

 

为了方便使用,常规siRNA产品以冻干粉形式提供,可以直接用于各种细胞RNAi实验。科研人员可以根据需要设计特定靶点,覆盖人、小鼠、大鼠全基因组的所有基因。同时,通过对siRNA进行化学修饰,可以提高其在体内实验中的高效性、特异性和稳定性。

 

RNA干扰(RNAi)是一种广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程,常常被用作基因沉默(基因干扰)的工具之一。siRNA作为RNAi的一种形式,具有非常广阔的应用前景。未来,siRNA还将继续发挥其独特的优势,成为治疗相关疾病的新趋势。

 

siRNA转染实验介绍

01- siRNA储存

常规化学合成的siRNA序列为21~23nt的双链小分子RNA,为冻干粉形式的即用型试剂 ,在常温不溶解的情况下可以保存至少1个月时间,放置于-20℃~-80℃低温环境中,冻干粉可以稳定保存一年。

 

02- 转染试剂储存

4℃保存,不可冷冻。

 

03-体外转染操作流程:

第一步、接种细胞:建议提前一天接种细胞,接种数量参考下方推荐量。

第二步、 转染复合液配制:

● siRNA稀释液配制:siRNA以水稀释至140 μg/mL。

● siRNA转染复合液配制:取无菌离心管,加入2μL siRNA稀释液,加入LipidnanoTM Super RNAi转染试剂A液14μL,吹打混匀,加入LipidnanoTM Super RNAi转染试剂B液4μL,混合均匀,室温放置5min,加培养液180μL,吹打混匀。

第三步、细胞加样:按下方推荐量将配制好的siRNA转染复合液加入各细胞孔中,摇动培养板,轻轻混匀。

第四步、细胞培养:37 ℃,5% CO2 培养箱培养,直至发挥干扰作用。建议24~48h测定mRNA水平、48~72h测定蛋白水平。

 

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